Что такое флуоресценция?

Флуоресценция, китайский термин, также пишущийся как «иньгуан», обозначает холодный люминесцентный явление, при котором вещество излучает свет после возбуждения падающим светом определённой длины волны — обычно ультрафиолетовым или рентгеновским. Когда вещество при комнатной температуре поглощает энергию от такого падающего света, оно переходит в возбуждённое состояние и затем мгновенно возвращается в основное состояние, испуская свет с большей длиной волны, чем у падающего света (обычно в пределах видимого спектра). У многих флуоресцирующих веществ излучение прекращается сразу же после того, как падающий свет убирают. Излучаемый свет с такими характеристиками называется флуоресценцией. Кроме того, некоторые вещества продолжают излучать свет относительно долго даже после выключения падающего света; это явление известно как фосфоресценция. В повседневной жизни люди часто в широком смысле называют любое слабое свечение флуоресценцией, не обращая внимания на детали или не различая механизмы, лежащие в основе люминесценции. Также флуоресценцией называют прохладный свет с низкой температурой (не цветовой температурой).

Принцип, лежащий в основе флуоресценции

Когда свет падает на определённые атомы, энергия света заставляет некоторые электроны, окружающие атомное ядро, перейти с их исходных орбит на орбиты с более высокой энергией — переходя из основного состояния в первое возбуждённое синглетное состояние или во второе возбуждённое синглетное состояние и так далее. Поскольку первое возбуждённое синглетное состояние или второе возбуждённое синглетное состояние являются нестабильными, они со временем возвращаются в основное состояние. Когда электроны возвращаются из первого возбуждённого синглетного состояния в основное, избыток энергии выделяется в виде света, что и приводит к флуоресценции.

Флуоресценция — это излучение света веществом после того, как оно поглотило свет или другое электромагнитное излучение. В большинстве случаев излучаемый свет имеет большую длину волны и меньшую энергию по сравнению с поглощённым светом. Однако при достаточно высокой интенсивности поглощения может происходить двухфотонное поглощение, в результате чего излучаемое излучение будет иметь более короткую длину волны, чем поглощённое. Когда длина волны излучаемого света совпадает с длиной волны поглощённого света, этот процесс называется резонансной флуоресценцией. Обычный пример — поглощение ультрафиолетового света веществом с последующим испусканием видимой флуоресценции. Флуоресцентные лампы, которые мы используем в повседневной жизни, работают именно по этому принципу: фосфорное покрытие внутри колбы лампы поглощает ультрафиолетовое излучение, испускаемое парами ртути внутри колбы, и затем повторно излучает видимый свет, делая его заметным для человеческого глаза.

Параметры флуоресценции

(1) Спектр возбуждения: Зависимость между интенсивностью или эффективностью люминесценции конкретной линии или полосы люминесцентного материала и длиной волны возбуждающего света при освещении светом разной длины волны.

(2) Спектр излучения: Изменение интенсивности люминесценции на различных длинах волн при возбуждении люминесцентного материала специфическим возбуждающим светом.

(3) Интенсивность флуоресценции: Интенсивность флуоресценции зависит от таких факторов, как квантовый выход флуоресценции, коэффициент поглощения и концентрация вещества.

(4) Квантовый выход флуоресценции Q: Квантовый выход характеризует способность вещества преобразовывать поглощённую световую энергию в флуоресценцию; он представляет собой отношение числа фотонов, испускаемых флуоресцирующим веществом, к числу поглощённых фотонов.

(5) Сдвиг Стокса: Сдвиг Стокса — это разница между длиной волны максимального излучения флуоресценции и длиной волны максимального поглощения.

(6) Время жизни флуоресценции: Когда пучок света возбуждает флуоресцирующее вещество, молекулы флуоресцирующего материала поглощают энергию и переходят из основного состояния в возбуждённое. Затем, возвращаясь в основное состояние, они испускают флуоресценцию в виде излучения. Время жизни флуоресценции определяется как время, необходимое для того, чтобы интенсивность флуоресценции молекул уменьшилась до 1/e от её максимальной интенсивности в момент прекращения возбуждения.

Квантовые точки из селенида кадмия излучают флуоресценцию при воздействии ультрафиолетового света.

Применения флуоресценции

Освещение

Люминесцентная лампа

Обычная люминесцентная лампа является ярким примером. Внутренняя полость ламповой трубки вакуумируется, а затем заполняется небольшим количеством ртути. Когда между электродами внутри трубки возникает электрический разряд, ртуть излучает свет в ультрафиолетовом спектре. Этот ультрафиолетовый свет невидим и опасен для здоровья человека. Поэтому внутренняя поверхность ламповой трубки покрывается веществом, называемым фосфором (или люминофором), которое поглощает ультрафиолетовый свет и переизлучает его в виде видимого света.

Светодиоды (LED), способные излучать белый свет, также работают по аналогичному принципу. Свет, излучаемый полупроводниками, имеет синий цвет, и этот синий свет может возбуждать люминофоры — например, фосфор — прикреплённые к отражающему электроду, заставляя их испускать оранжевую флуоресценцию. Когда эти два цвета света смешиваются вместе, они дают приближение к белому свету.

Хайлайтер

Фломастеры для выделения текста содержат флуоресцентные красители, которые дают флуоресцентный эффект при воздействии ультрафиолетового света — например, солнечного света, ламп дневного света или ртутных ламп. Под ультрафиолетовым освещением эти фломастеры излучают белый свет, придавая цветам яркий, флуоресцентный вид. Флуоресценция фломастеров отличается от флуоресценции часов или светящихся палочек: светящиеся палочки основаны на внутренней радиоактивной реакции, которая генерирует излучение, в свою очередь возбуждающее окружающий флуоресцентный порошок и заставляющее его светиться. В результате светящиеся палочки могут продолжать светиться даже в отсутствие любого ультрафиолетового света ночью. Напротив, фломастеры проявляют флуоресценцию только при воздействии ультрафиолетового света. Вы легко можете это проверить, поднеся маркер фломастера близко к ловушке для комаров или детектору банкнот — оба устройства излучают ультрафиолетовый свет.

Биохимический и медицинский

Флуоресценция имеет широкий спектр применений в области биохимии и медицины. С помощью химических реакций флуоресцентные химические группы можно присоединять к биомолекулам, после чего эти биомолекулы можно чувствительно обнаруживать путём наблюдения за флуоресценцией, излучаемой маркированными группами.

Профиль секвенирования ДНК, полученный с использованием флуоресцентно меченого агента, прекращающего цепь.

Метод терминации цепи для автоматизированного секвенирования ДНК: в оригинальном методе концы праймеров ДНК необходимо было маркировать флуоресцентными красителями, чтобы обеспечить точную идентификацию полос ДНК на секвенционном геле. В усовершенствованном методе четыре типа дидезоксинуклеотидов (ddNTP), которые служат терминаторами цепи, каждый маркируются отдельно флуоресцентными красителями. После электрофореза молекулы ДНК разной длины разделяются в зависимости от их размеров. При облучении ультрафиолетовым светом четыре различно маркированных дидезоксинуклеотида испускают флуоресценцию на разных длинах волн. Анализируя спектр флуоресценции, можно точно определить последовательность ДНК. Обнаружение ДНК: бромид этидиума — это флуоресцентный краситель, который излучает лишь очень слабую флуоресценцию, когда свободно меняет свою конформацию в растворе. Однако, как только он встраивается между парами оснований двойной спирали нуклеиновых кислот и связывается с молекулами ДНК, он начинает интенсивно флуоресцировать. Поэтому бромид этидиума обычно добавляют во время гель-электрофореза для окрашивания ДНК. ДНК-микрочипы (биочипы): геномные зонды должны быть маркированы флуоресцентными красителями, а целевые последовательности в конечном итоге идентифицируются путем анализа полученных флуоресцентных сигналов. Иммунофлуоресцентный анализ в иммунологии: антитела маркируют флуоресцентными красителями, что позволяет исследователям определять местоположение и природу антигенов на основе распределения и морфологии флуоресценции. Проточная цитометрия (также известная как активируемое флуоресценцией сортирование клеток, FACS): образцы клеток маркируют флуоресцентными красителями, затем возбуждают лазерными лучами для получения специфической флуоресценции. Излучаемая флуоресценция детектируется оптической системой и передается на компьютер для анализа, тем самым выявляя различные характеристики клеток. Флуоресцентная технология также применяется для обнаружения и анализа молекулярных структур ДНК и белков, особенно сложных биологических макромолекул. Люминесцентный белок медузы был впервые выделен из морского организма Aequorea victoria. В присутствии ионов кальция он излучает зелёную флуоресценцию. Эта особенность была использована для наблюдения в реальном времени за движением ионов кальция внутри клеток. Открытие люминесцентного белка медузы послужило толчком для дальнейших исследований морских медуз и привело к идентификации зелёного флуоресцентного белка (GFP). Полипептидная цепь GFP содержит уникальную хромофорную структуру, которая позволяет ему испускать стабильную зелёную флуоресценцию при воздействии ультрафиолетового света без необходимости дополнительных кофакторов или специальных обработок. В результате GFP и родственные ему белки стали незаменимыми инструментами в биохимических и клеточных исследованиях. Флуоресцентная микроскопия: флуоресцентная микроскопия с полным внутренним отражением — многие биомолекулы обладают собственной флуоресценцией и могут излучать свет без необходимости добавления дополнительных химических групп. Иногда эта собственная флуоресценция может изменяться в ответ на условия окружающей среды, что позволяет использовать эту чувствительность к внешней среде для обнаружения распределения и свойств молекул. Например, билирубин, связываясь с определённым участком сывороточного альбумина, даёт яркую флуоресценцию. Аналогично, когда эритроциты лишены железа или содержат свинец, они вместо нормального гема (гемоглобина) производят протопорфирин цинка; протопорфирин цинка проявляет интенсивную флуоресценцию и поэтому может использоваться для выявления первопричины некоторых заболеваний.

Драгоценные камни, минералы

Драгоценные камни, минералы, волокна и другие материалы, которые могут служить судебно-медицинскими доказательствами, при воздействии ультрафиолетового или рентгеновского излучения могут испускать флуоресценцию различного характера.

Рубины, изумруды и бриллианты могут испускать красное флуоресцентное излучение под ультрафиолетовым светом коротковолнового диапазона. Изумруды, топаз (жёлтый нефрит) и жемчуг также способны флуоресцировать под ультрафиолетовым светом. Кроме того, бриллианты могут проявлять фосфоресценцию под рентгеновскими лучами.

Концептуальное различие

Люминесценция, вызванная возбуждением светом (обычно ультрафиолетовым или рентгеновским), называется фотолюминесценцией; к ней относятся такие явления, как флуоресценция и фосфоресценция. Люминесценция, обусловленная химическими реакциями, известна как хемилюминесценция; флуоресцентные палочки, используемые на концертах, излучают свет благодаря химической реакции, запускаемой при смешивании двух жидких химических веществ. Люминесценция, вызванная катодными лучами (потоком высокоэнергетических электронов), называется катодолюминесценцией — именно так излучает свет флуоресцентный экран в кинескопе телевизора. Явление холодной люминесценции в живых организмах называется биолюминесценцией; например, свет, излучаемый светлячками, именуют «иньгуан». В древнекитайском языке иероглиф «инь» использовался взаимозаменяемо с иероглифом «ин», а в некоторых китайскоязычных регионах иероглиф «инь» конкретно ассоциируется с насекомыми. На Тайване флуоресценцию часто называют «иньгуан»; на материковом Китае её чаще именуют просто «иньгуан», тогда как термин «иньгуан» обычно относится именно к свету, излучаемому светлячками.

Инструмент

Измерение флуоресценции обязательно требует использования прибора. Прибор, обычно используемый для определения количества флуоресценции, содержащейся в веществе, называется флуоресцентным спектрофотометром.

Основная структура флуоресцентного анализатора включает: источник возбуждающего света, возбуждающий монochроматор, камеру для образца, эмиссионный монochроматор и систему детектирования.