Флуоресцентный микроскоп — это разновидность оптического микроскопа. Когда исследуемый образец прозрачен или его внутренние структуры невозможно чётко различить по цвету, флуоресцентный микроскоп становится отличным выбором, поскольку он позволяет преодолеть ограничения обычных микроскопов при наблюдении прозрачных материалов. Принцип работы флуоресцентного микроскопа заключается в освещении образца, окрашенного флуоресцентным красителем, светом коротковолнового диапазона, который возбуждает молекулы красителя и заставляет их излучать флуоресценцию большей длины волны. Это позволяет наблюдателям детально изучить внутреннюю структуру образца. В флуоресцентном микроскопе крайне важно выбирать конкретные длины волн возбуждающего света из источника освещения для получения флуоресценции. Затем необходимо отделить флуоресценцию от смешанного света, состоящего как из возбуждающего, так и из излучаемого света, чтобы можно было чётко её увидеть. Поэтому фильтровые системы, избирательно пропускающие определённые длины волн, играют чрезвычайно важную роль в этом процессе. Флуоресцентные микроскопы широко применяются в таких областях, как биология и медицина.
Флуоресцентный микроскоп состоит из следующих основных компонентов:
а. Источник света: как правило, ксеноновая дуговая лампа или ртутная лампа, однако в последние годы также применяются светодиоды высокой мощности.
б. Фильтр (падающий свет): Этот фильтр уменьшает длину волны падающего света, оставляя только ту длину волны, которая необходима для возбуждения образца; интересно, что его называют фильтром возбуждения.
c. Двустороннее дихроичное зеркало или отражатель: отражает возбуждающий свет на образец и одновременно пропускает только излучаемый свет, исходящий от образца, к детектору (как показано на рисунке ниже).
d. Фильтр эмиссии: он пропускает только длины волн излучения, исходящие от образца, и блокирует весь свет, прошедший через фильтр возбуждения. Как вы могли бы ожидать, его называют фильтром эмиссии.
е. Камера ПЗС: Если излучаемый свет не может быть обнаружен, камера становится совершенно бесполезной. Для флуоресцентной визуализации детектором обычно служит камера ПЗС, которая обычно подключается к экрану компьютера и позволяет отображать изображение для вас.
Дихроичный делитель луча пропускает через фильтр свет с более длинными волнами, отражая при этом свет с более короткими волнами.
Классификация флуоресцентных микроскопов:
Флуоресцентные микроскопы обычно делятся на два типа: с проходящим светом и с отражённым светом.
а. Тип освещения: Возбуждающий свет исходит из-под образца, а конденсор является конденсором темного поля, который предотвращает попадание возбуждающего света в объектив, одновременно позволяя флуоресцентному свету проходить в него. При низком увеличении изображение выглядит ярким; при высоком увеличении оно становится темным. Этот тип освещения относительно трудно настроить при использовании масляной иммерсии или центрировании микроскопа, особенно при определении подходящего диапазона освещения при низких увеличениях. Однако он способен создать очень темный фон для образца. Метод освещения типа «передача» не подходит для образцов, которые не прозрачны.
б. Эпиосвещение: Хотя микроскопия с проходящим светом в значительной степени вышла из употребления, большинство современных флуоресцентных микроскопов теперь используют эпиосвещение. В этой конфигурации источник света располагается над образцом, а в оптический путь включён делитель луча, что делает прибор подходящим как для прозрачных, так и для непрозрачных образцов. Поскольку объектив выполняет функцию конденсора, такая установка не только упрощает эксплуатацию, но и обеспечивает равномерное освещение всего поля зрения — от низкого до высокого увеличения.
